Protective effect of electroacupuncture at ST36 against damage of intestinal mucosa，oxidative stress and apoptosis induced by 5-FU chemotherapy in mice with colon cancer

ZHANG Xue-jun; LIN Jiu-mao; LIN Chen-jie; PENG Jiao; YANG Xiao-dan; CHEN Shi-lan; ZHAO Jin-yan

doi:10.13702/j.1000-0607.20220841

您当前的位置：

首页 >

文章列表页 >

Protective effect of electroacupuncture at ST36 against damage of intestinal mucosa，oxidative stress and apoptosis induced by 5-FU chemotherapy in mice with colon cancer

更新时间：2023-12-25

- Protective effect of electroacupuncture at ST36 against damage of intestinal mucosa，oxidative stress and apoptosis induced by 5-FU chemotherapy in mice with colon cancer
- Acupuncture Research Vol. 48, Issue 12, Pages: 1249-1257(2023)
- 作者机构：
  
  1.福建中医药大学针灸学院，福州 350122
  2.福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122
  3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福州 350122
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13702/j.1000-0607.20220841
  CLC： R245.9⁺7
- Received：25 July 2022，
  
  Revised：11 November 2022，
  
  Published：25 December 2023
- 稿件说明：
移动端阅览
张学君,林久茂,林晨捷等.电针“足三里”减轻大肠癌小鼠化疗后肠黏膜损伤及其对氧化应激和细胞凋亡的影响[J].针刺研究,2023,48(12):1249-1257.

ZHANG Xue-jun,LIN Jiu-mao,LIN Chen-jie,et al.Protective effect of electroacupuncture at ST36 against damage of intestinal mucosa，oxidative stress and apoptosis induced by 5-FU chemotherapy in mice with colon cancer[J].Acupuncture Research,2023,48(12):1249-1257.
张学君,林久茂,林晨捷等.电针“足三里”减轻大肠癌小鼠化疗后肠黏膜损伤及其对氧化应激和细胞凋亡的影响[J].针刺研究,2023,48(12):1249-1257. DOI： 10.13702/j.1000-0607.20220841.

ZHANG Xue-jun,LIN Jiu-mao,LIN Chen-jie,et al.Protective effect of electroacupuncture at ST36 against damage of intestinal mucosa，oxidative stress and apoptosis induced by 5-FU chemotherapy in mice with colon cancer[J].Acupuncture Research,2023,48(12):1249-1257. DOI： 10.13702/j.1000-0607.20220841.

摘要

目的

观察电针“足三里”对大肠癌荷瘤小鼠5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗后肠黏膜损伤的减轻作用及对结肠组织氧化应激及细胞凋亡的影响，探讨电针缓解化疗后肠黏膜损伤的部分机制。

方法

BALB/c小鼠随机分为正常组、CT26组、5-FU组、非穴组和足三里组，每组6只。除正常组外，其余4组采用大肠癌CT26细胞皮下注射种植移植瘤；5-FU组、非穴组和足三里组腹腔注射 5-FU（5 mg/mL）溶液，每3 d注射 1次，共7次。足三里组和非穴组小鼠在每次给予5-FU腹腔注射后进行电针，足三里组电针双侧“足三里”，非穴组电针双侧非穴，每次5 min，3 d治疗1次，共治疗21 d。治疗结束后评估小鼠腹泻指数，测量小鼠结肠长度；HE染色法观察小鼠结肠黏膜病理形态，测量结肠绒毛长度；生化分析法检测小鼠结肠组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；TUNEL法检测小鼠结肠组织细胞凋亡水平；免疫组织化学法检测小鼠结肠组织B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白（Bax）阳性表达水平。

结果

与正常组比较，CT26组小鼠腹泻指数、结肠长度、结肠绒毛长度、MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性、细胞凋亡率、Bax、Bcl-2阳性表达率差异均无统计学意义。与CT26组比较，5-FU组小鼠腹泻指数升高（

0.01），结肠长度及结肠绒毛均缩短（

0.01），结肠组织MDA含量升高（

0.05），SOD和GSH-Px活性降低（

0.01），细胞凋亡率升高（

0.01），Bax阳性表达升高（

0.05），Bcl-2阳性表达率降低（

0.01）。与5-FU组比较，足三里组小鼠腹泻指数降低（

0.01），结肠长度及结肠绒毛均增长（

0.01），结肠组织MDA含量降低（

0.05），SOD和GSH-Px活性升高（

0.01），细胞凋亡率降低（

0.01），Bax表达降低（

0.05），Bcl-2表达升高（

0.01）；非穴组小鼠结肠绒毛长度增长（

0.01），结肠组织SOD、GSH-Px活性升高（

0.05，

0.01），结肠组织细胞凋亡率降低（

0.01）。

结论

电针“足三里”可减轻大肠癌荷瘤小鼠5-FU化疗后肠黏膜损伤，其作用机制可能与调节结肠组织氧化应激、抑制细胞凋亡有关。

Abstract

Objective

To observe the effect of electroacupuncture （EA） at “Zusanli”（ST36） on intestinal mucosal damage，intestinal mucosal oxidative stress injury and apoptosis induced by 5-fluorouraeil （5-FU） chemotherapy in colorectal cancer-bearing mice.

Methods

Thirty male BALB/c mice were randomly divided into normal control，colorectal cancer （CT26），5-FU， non-acupoint and ST36 groups，with 6 mice in each group. Except for those of the normal control group，mice of the remaining 4 groups received subcutaneous implantation of colorectal CT26 cell suspension （0.1 mL） in the right armpit for establishing colorectal cancer model. Rats of the 5-FU group， non-acupoint group and ST36 group were given with 5 mg/mL 5-FU solution once every 3 days for a total of 21 days. For mice of the non-acupoint group and ST36 group， EA （2 Hz， 1—2 mA） was applied to bilateral ST36 or non-acupoints （the bilateral sunken spots about 3 mm to the midpoint between the tail root and the anus） for 5 min after each intraperitoneal infusion of 5-FU，once every 3 days， for a total of 21 days. After the intervention， the diarrhea index was assessed. The length of colon （from the endpoint of cecum to the anal orifice） was measured. Histopathological changes of colonic mucosa were observed by H.E. staining， and the length of colonic villi was measured. The content of malondialdehyde （MDA）， and activities of superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px） of colonic tissue were detected by thibabituric acid， xanthine oxidase and colorimetric method， respectively. The rate of cell apoptosis in the colonic tissue was measured by TUNEL assay. The positive expressions of Bax and Bcl-2 in colonic tissue were determined by immunohistochemistry.

Results

The CT26 model group didn’t show any significant changes in the diarrhea index， colon length， colon villus length， MDA content， SOD and GSH-Px activities， colonic cell apoptosis rate， and Bax and Bcl-2 expression levels when compared with the normal group

Compared with the CT26 group，the 5-FU group had a remarkable increase in the diarrhea index， MDA content， colonic cell apoptosis rate and Bax expression level （

0.01，

0.05）， and a marked decrease in the colon length， colon villus length， SOD and GSH-Px activities and Bcl-2 expression level （

0.01）， suggesting the side effects of administration of 5-FU. Compared with the 5-FU group， the diarrhea index， MDA content， colonic cell apoptosis rate and Bax expression level were markedly decreased （

0.05，

0.01） and those of the colon length， colon villus length， SOD and GSH-Px activities and Bcl-2 expression level were obviously increased （

0.01） in the ST36 group. Compared with the 5-FU group， the non-acupoint group also had an increase in the colon villus length， SOD and GSH-Px activities （

0.01，

0.05） and a decrease in the cell apoptosis rate （

0.01）.

Conclusion

EA at ST36 has a positive effect in reducing intestinal mucosal damage induced by 5-FU chemotherapy in cancer-bearing mice， which may be related to its function in relieving oxidative stress injury and inhibiting apoptosis of colonic tissue.

关键词

Keywords

references

SIEGEL R L ， MILLER K D ， JEMAL A . Cancer statistics，2020 ［J］. CA Cancer J Clin ， 2020 ， 70 （ 1 ）： 7 - 30 .

WANG C H ， YANG S X ， GAO L ， et al . Carboxymethyl pachyman （CMP） reduces intestinal mucositis and regulates the intestinal microflora in 5-fluorouracil-treated CT26 tumour-bearing mice ［J］. Food Funct ， 2018 ， 9 （ 5 ）： 2695 - 2704 .

FOCACCETTI C ， BRUNO A ， MAGNANI E ， et al . Effects of 5-fluorouracil on morphology， cell cycle， proliferation， apoptosis， autophagy and ROS production in endothelial cells and cardiomyocytes ［J］. PLoS One ， 2015 ， 10 （ 2 ）： e0115686 .

SUN Z G ， HU Y Z ， WANG Y G ， et al . Bupihewei Decoction ameliorates 5-FU-induced intestinal mucosal injury in the rats by regulating the TLR-4/NF-κB signaling pathway ［J］. Evid Based Complement Alternat Med ， 2019 ， 2019 ： 5673272 .

黄瑞，邬继红，王胜兰 . 艾灸对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠黏膜损伤及结肠远端黏膜层CGRP阳性神经纤维表达的影响［J］. 中国针灸， 2021 ， 41 （ 10 ）： 1127 - 1134 .

HUANG R ， WU J H ， WANG S L . Effect of moxibustion on colonic mucosal injury and expression of CGRP positive nerve fibers of distal colonic mucosa in ulcerative colitis mice （in Chinese）［J］. Chinese Acupuncture & Moxibustion ， 2021 ， 41 （ 10 ）： 1127 - 1134 .

张秀丽 . 足三里化脓灸防治消化道恶性肿瘤化疗后不良反应39例临床观察［J］. 湖南中医杂志， 2018 ， 34 （ 12 ）： 70 - 71 .

ZHANG X L . Clinical observation on prevention and treatment of 39 cases of adverse reactions of digestive tract malignant tumor after chemotherapy with purulent moxibustion at Zusanli （in Chinese）［J］. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine ， 2018 ， 34 （ 12 ）： 70 - 71 .

齐静 . 针灸防治化疗相关消化道反应疗效观察［J］. 辽宁中医药大学学报， 2018 ， 20 （ 1 ）： 216 - 218 .

QI J . Observation of curative effect on prevention and treatment of chemotherapy related digestive tract reaction by acupuncture （in Chinese）［J］. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine ， 2018 ， 20 （ 1 ）： 216 - 218 .

叶毅君，陆虞荪，周雪，等 . 针刺对5-氟尿嘧啶所致肠黏膜屏障破坏大鼠的保护作用［J］. 针刺研究， 2016 ， 41 （ 2 ）： 95 - 99 .

YE Y J ， LU Y S ， ZHOU X ， et al . Protective effects of acupuncture intervention against damage of intestinal mucosal barrier induced by 5-fluorouracil in rats （in Chinese）［J］. Acupuncture Research ， 2016 ， 41 （ 2 ）： 95 - 99 .

吴阳阳，刘明江，殷韶杰，等 . 针刺对溃疡性结肠炎大鼠氧化应激和内质网应激的影响［J］. 针刺研究， 2020 ， 45 （ 1 ）： 8 - 14 .

WU Y Y ， LIU M J ， YIN S J ， et al . Acupuncture reduce colonic inflammation by suppressing oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in rats with ulcerative colitis （in Chinese）［J］. Acupuncture Research ， 2020 ， 45 （ 1 ）： 8 - 14 .

樊雨倩，袁思成，王和生 . 针灸对肠道黏膜屏障保护机制的研究进展［J］. 湖南中医杂志， 2022 ， 38 （ 1 ）： 184 - 187 .

FAN Y Q ， YUAN S C ， WANG H S . Research progress on protective mechanism of acupuncture and moxibustion on intestinal mucosal barrier （in Chinese）［J］. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine ， 2022 ， 38 （ 1 ）： 184 - 187 .

ABULIZI A ， HU L ， MA A ， et al . Ganoderic acid alleviates chemotherapy-induced fatigue in mice bearing colon tumor ［J］. Acta Pharmacol Sin ， 2021 ， 42 （ 10 ）： 1703 - 1713 .

中国针灸学会 . 实验动物常用穴位名称与定位第3部分：小鼠［J］. 针刺研究， 2021 ， 46 （ 5 ）： 445 - 446 .

China Association of Acupuncture-Moxibustion . Nomenclature and location of acupoints commonly used in laboratory animals. Part 3： mice（in Chinese）［J］. Acupuncture Research ， 2021 ， 46 （ 5 ）： 445 - 446 .

卜婉萍，杨晓婷，林燊，等 . 针刺足三里对端粒酶基因敲除小鼠免疫细胞因子表达影响的研究［J］. 江西中医药大学学报， 2018 ， 30 （ 4 ）： 56 - 58， 64 .

BU W P ， YANG X T ， LIN S ， et al . Study about the expression of immune cytokines from telomeraseknockout mice by acupuncture of ST36 point （in Chinese）［J］. Journal of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine ， 2018 ， 30 （ 4 ）： 56 - 58， 64 .

姚俊鹏，赵妍，陈颖，等 . 电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠上皮黏膜屏障功能的影响［J］. 针刺研究， 2020 ， 45 （ 5 ）： 357 - 362 .

YAO J P ， ZHAO Y ， CHEN Y ， et al . Effect of electroacupuncture on intestinal epithelial mucosal barrier function in rats with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome （in Chinese）［J］. Acupuncture Research ， 2020 ， 45 （ 5 ）： 357 - 362 .

RASHID S ， ALI N ， NAFEES S ， et al . Mitigation of 5-fluorouracil induced renal toxicity by chrysin via targeting oxidative stress and apoptosis in Wistar rats ［J］. Food Chem Toxicol ， 2014 ， 66 ： 185 - 193 .

TSUYUKI S ， KAWAGUCHI K ， KAWATA Y ， et al . Usefulness of antimycotic agents （itraconazole） in chemotherapy-induced mucositis of breast cancer patients ［J］. Gan To Kagaku Ryoho ， 2012 ， 39 （ 9 ）： 1369 - 1373 .

刘慧，冯丹青，邵诗芸，等 . 健脾解毒方调控TLRs/NF-κB信号通路对5-FU致大鼠肠黏膜炎的保护作用［J］. 上海中医药杂志， 2020 ， 54 （ 12 ）： 84 - 90 .

LIU H ， FENG D Q ， SHAO S Y ， et al . Jianpi Jiedu Formula alleviated 5-FU-induced intestinal mucositis in rats through inhibiting TLRs/NF-κB signaling pathway （in Chinese）［J］. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine ， 2020 ， 54 （ 12 ）： 84 - 90 .

刘端勇，黄敏芳，徐荣，等 . 黄芪多糖对结肠炎大鼠小肠PP结中T淋巴细胞亚群的调节作用［J］. 中国药理学通报， 2015 ， 31 （ 9 ）： 1328 - 1329 .

LIU D Y ， HUANG M F ， XU R ， et al . Effect of Astragalus polysaccharides in regulating the T lymphocyte subgroup in intestinal PPs of rat with colitis （in Chinese）［J］. Chinese Pharmacological Bulletin ， 2015 ， 31 （ 9 ）： 1328 - 1329 .

LI F L ， WANG J ， WU N ， et al . H1， a derivative of tetrandrine， enhances the efficacy of 5-FU in Bel7402/5-FU cells via suppressing STAT3/MCL-1 and inducing PUMA ［J］. Biochem Biophys Res Commun ， 2019 ， 520 （ 1 ）： 93 - 98 .

张新峰，乔翠霞，程旭锋，等 . 中西医结合治疗不同中医证型化疗相关性腹泻［J］. 中成药， 2015 ， 37 （ 9 ）： 1914 - 1916 .

ZHANG X F ， QIAO C X ， CHENG X F ， et al . Managing chemotherapy-induced diarrhea in different TCM patterns with integrative medicine （in Chinese）［J］. Chinese Traditional Patent Medicine ， 2015 ， 37 （ 9 ）： 1914 - 1916 .

许雅青，吴月滢，李小雅，等 . 健脾类中药修复肠黏膜屏障损伤的研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志， 2021 ， 27 （ 14 ）： 235 - 241 .

XU Y Q ， WU Y Y ， LI X Y ， et al . Efficacy of spleen-invigorating Chinese medicinals in repairing intestinal mucosal barrier injury： a review （in Chinese）［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae ， 2021 ， 27 （ 14 ）： 235 - 241 .

罗蒙 . 从Ca 2+ 调节及细胞连接角度探讨四君子汤多糖肠黏膜保护作用［D］. 广州：广州中医药大学， 2021 .

LUO M . Study on the protective effect of Sijunzi Decoction polysaccharide on intestinal mucosa from the perspective of Ca 2+ regulation and cell-to-cell connection （in Chinese）［D］. Guangzhou ： Guangzhou University of Chinese Medicine ， 2021 .

LI Y M ， XU G C ， HU S ， et al . Electroacupuncture alleviates intestinal inflammation and barrier dysfunction by activating dopamine in a rat model of intestinal ischaemia ［J］. Acupunct Med ， 2021 ， 39 （ 3 ）： 208 - 216 .

袁伟渠，杨卓欣，周玉梅，等 . 基于阴阳平衡理论探讨针灸与肠道微生态的关系［J］. 世界科学技术-中医药现代化， 2020 ， 22 （ 11 ）： 4009 - 4016 .

YUAN W Q ， YANG Z X ， ZHOU Y M ， et al . Discussion on the relationship between acupuncture and intestinal microeco-logy based on yin - yang balance theory （in Chinese）［J］. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology ， 2020 ， 22 （ 11 ）： 4009 - 4016 .

吴阳阳 . 针刺足三里和曲池穴对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用研究［D］. 扬州：扬州大学， 2018 .

WU Y Y . Therapeutic effects of acupuncture at Zusanli and Quchi on ulcerative colitis in rats （in Chinese）［D］. Yangzhou ： Yangzhou University ， 2018 .

刘欢 . 电针对重症患者胃肠功能障碍的疗效观察［D］. 南京：南京中医药大学， 2021 .

LIU H . Observation on the effect of electroacupuncture on gastrointestinal dysfunction （in Chinese）［D］. Nanjing ： Nanjing University of Chinese Medicine ， 2021 .

陈若冰，吴素琴，姜玥，等 . 薯蓣皂苷元抑制碘酸钠诱发ARPE-19细胞氧化应激反应［J］. 中国老年学杂志， 2022 ， 42 （ 11 ）： 2783 - 2786 .

CHEN R B ， WU S Q ， JIANG Y ， et al . Diosgenin inhibits oxidative stress induced by sodium iodate in ARPE-19 cells （in Chinese）［J］. Chinese Journal of Gerontology ， 2022 ， 42 （ 11 ）： 2783 - 2786 .

王亚茹，袁满，张丽，等 . 槲皮素抗氧化作用及相关机制研究进展［J］. 营养学报， 2022 ， 44 （ 2 ）： 204 - 208 .

WANG Y R ， YUAN M ， ZHANG L ， et al . Research progress on antioxidant actions and related mechanisms of quercetin （in Chinese）［J］. Acta Nutrimenta Sinica ， 2022 ， 44 （ 2 ）： 204 - 208 .

JI J ， HUANG Y ， WANG X F ， et al . Review of clinical studies of the treatment of ulcerative colitis using acupuncture and moxibustion ［J］. Gastroenterol Res Pract ， 2016 ， 2016 ： 9248589 .

张艳芳，余剑波 . 穴位刺激在脓毒症脏器损伤中的保护作用及机制［J］. 国际麻醉学与复苏杂志， 2017 ， 38 （ 12 ）： 1143 - 1147 .

ZHANG Y F ， YU J B . Protective effects of acupuncture on organs in patients with sepsis and possible underlying mechanisms （in Chinese）［J］. International Journal of Anesthesiology and Resuscitation ， 2017 ， 38 （ 12 ）： 1143 - 1147 .

胡森，张立俭，白慧颖，等 . 电针足三里穴对腹腔脓毒症大鼠肠缺血及氧自由基损伤的作用研究［J］. 中国危重病急救医学， 2009 ， 21 （ 8 ）： 485 - 487 .

HU S ， ZHANG L J ， BAI H Y ， et al . The effects of at Zusanli point on intestinal proinflammatory factors， diamine oxidase and tissue water content in rats with sepsis （in Chinese）［J］. Chinese Critical Care Medicine ， 2009 ， 21 （ 8 ）： 485 - 487 .

ZAMAN S ， WANG R ， GANDHI V . Targeting the apoptosis pathway in hematologic malignancies ［J］. Leuk Lymphoma ， 2014 ， 55 （ 9 ）： 1980 - 1992 .

张志斌，陆曙，周春刚，等 . 当归补血汤对大鼠动脉内皮细胞凋亡的干预作用［J］. 中国实验方剂学杂志， 2013 ， 19 （ 3 ）： 215 - 218 .

ZHANG Z B ， LU S ， ZHOU C G ， et al . Intervention of Danggui Buxue Decoction on apoptosis in rat arterial endothelial cells （in Chinese）［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae ， 2013 ， 19 （ 3 ）： 215 - 218 .

TSUCHIYA A ， YASUNAGA H ， TSUTSUMI Y ， et al . Nationwide observational study of mortality from complicated intra-abdominal infections and the role of bacterial cultures ［J］. Br J Surg ， 2019 ， 106 （ 5 ）： 606 - 615 .

楼屹，朱之青，谢莉莉，等 . 电针“足三里”对脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障的影响及机制研究［J］. 针刺研究， 2022 ， 47 （ 5 ）： 386 - 392 .

LOU Y ， ZHU Z Q ， XIE L L ， et al . Electroacupuncture at “Zusanli”（ST36） protects intestinal mucosal immune barrier by suppressing apoptosis of intestinal lymphocytes and regulating expression of Bcl-2 and Bax in sepsis rats （in Chinese）［J］. Acupuncture Research ， 2022 ， 47 （ 5 ）： 386 - 392 .

李禄 . 针刺足三里、天枢穴修复脾气虚证大鼠小肠胆碱能神经和平滑肌细胞损伤研究［D］. 大连：大连医科大学， 2014 .

LI L . The study of repairment of acupuncture at Zusanli（ST36） and Tianshu（ST25） on damagement of cholinergic nerves and SMC in small intestine of rats with syndrome of deficiency of spleen- qi （in Chinese）［D］. Dalian ： Dalian Medical University ， 2014 .

Views

下载量

CNKI被引量

Alert me when the article has been cited

提交

Tools

Publicity Resources

Exploration of the mechanism of electroacupuncture at “Jiaji” （EX-B2） in treating neuronal apoptosis in rats with spinal cord injury based on the JAK2/STAT3 pathway

Effects of electroacupuncture on cortactin and cytoskeletal stability in lung tissue of mice with chronic obstructive pulmonary disease

Related Author

MA Xue

LIU Fan

WANG Qiang

WANG Yuan

LIU Zhi-bin

ZHANG Xue-jun

LIN Jiu-mao

LIN Chen-jie

Related Institution

College of Acupuncture and Moxibustion， Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine

Shaanxi Key Laboratory of Acupuncture and Herbal Medicine

Shaanxi Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Encephalopathy

College of Acupuncture and Moxibustion，Fujian University of Traditional Chinese Medicine

College of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine

Postal code：100700
Tel：010-64089344,84014607 Email：zcyjbjb@vip.163.com
Technical support is provided by Beijing Founder electronics co., LTD 京ICP备05017590号-8 京公网安备11010802020460号
It is recommended to read the content of this site in Chrome&IE9+. Please switch to extreme mode in browser 360.
Cookies We use cookies to help provide and enhance our service and tailor content. By continuing, you agree to the use of cookies.

⁰